养肺控瘤方对Lewis晚期肺癌小鼠的抑瘤作用及对白介素—2和肿瘤坏死因子—α表达的影响

摘要 目的：观察养肺控瘤方对Lewis晚期肺癌小鼠模型的抑瘤作用及对血清白介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响。方法：选取30只C57BL/6雄性小鼠，采用胸腔注射Lewis肺癌细胞悬液制作Lewis晚期肺癌小鼠。造模后随机分为6组：空白对照组、顺铂组、等效剂量中药组、高剂量中药组、顺铂+等效剂量中药组、顺铂+高剂量中药组，每组5只。计算各组抑瘤率，并采用酶联免疫吸附试验检测血清中IL-2、TNF-α的表达。结果：顺铂组、等效剂量中药组、高剂量中药组、顺铂+等效剂量中药组、顺铂+高剂量中药组的抑瘤率分别为57.52%，30.88%，51.15%，67.73%，82.75%。與空白对照组比较，各观察组血清IL-2、TNF-α水平均得到显著下降（P<0.05），顺铂+高剂量中药组与顺铂组比较，血清IL-2、TNF-α水平显著下降（P<0.05）。结论：养肺控瘤方能抑制肿瘤生长，并能与顺铂协同降低Lewis晚期肺癌小鼠模型血清IL-2、TNF-α的表达。

关键词 养肺控瘤方；Lewis晚期肺癌；小鼠；抑瘤作用；白介素-2；肿瘤坏死因子-α

Abstract Objective：To observe the tumor-inhibitory effect of Yangfei Kongliu Fang and its effect on the expression of serum IL-2 and TNF-α in mouse models with advanced Lewis lung carcinoma. Methods：By using Lewis lung carcinoma cell suspensions via intrapleural injection， 30 male C57BL/6 mice were prepared into mouse models with advanced Lewis lung carcinoma. After model establishment， the mice were randomly divided into 6 groups： normal saline group （group C/control group）， cisplatin group （DDP group）， group treated with an equivalent dose of Chinese medicinals （group L）， group treated with a high dose of Chinese medicinals （group H）， group treated with cisplatin+equivalent dose of Chinese medicinals （group L+DDP）， and group treated with cisplatin+high dose of Chinese medicinals （group H+DDP）. Each group contained 5 mice and underwent corresponding intervention. Then， the tumor inhibition rate in each group was calculated， and the ELISA method was used to measure the expression of serum IL-2 and TNF-α. Results：The tumor inhibition rates in the DDP group， group L， group H， group L+DDP and group H+DDP were 57.52%， 30.88%， 51.15%， 67.73% and 82.75%， respectively. Compared with the control group， each treatment group achieved significant decreases in the levels of serum IL-2 and TNF-α （P<0.05）； and in group H+DDP as compared with DDP group， there were significant decreases in the levels of serum IL-2 and TNF-α （P<0.01）. Conclusion：Yangfei Kongliu Fang can inhibit tumor growth and can cooperate with cisplatin to reduce the expression of serum IL-2 and TNF-α in mouse models with advanced Lewis lung carcinoma.

Key Words Yangfei Kongliu Fang， Mouse with advanced Lewis lung carcinoma， Tumor-inhibitory effect， IL-2， TNF-α

中图分类号：R289.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.043

原发性支气管癌起源于支气管黏膜或腺体，简称肺癌，是临床最为常见的恶性肿瘤，近年来其发病率、死亡率呈逐渐上升趋势[1]，肺癌在城市肿瘤死亡顺序中已经由原来的第4位上升至第1位。70%～80%肺癌患者初诊即为晚期，丧失了手术根治的机会[2]。目前临床将肺癌概括为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两大类[3]。晚期非小细胞肺癌目前治疗多采取综合性治疗，其中涵盖放疗、化疗、分子靶向治疗、免疫治疗、中医中药治疗、最佳支持治疗等[4]。近年来临床医生更多的开始追求患者生命质量而不仅仅是杀灭和缩小肿瘤[5]。在长期的晚期非小细胞肺癌的中西医结合临床实践中，我科制定了养肺控瘤协定方，临床疗效确切，本研究通过制作晚期Lewis肺癌小鼠模型，探讨养肺控瘤方治疗晚期非小细胞肺癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 C57BL/6小鼠，雄性，体质量平均（20±3）g，购自常州卡文斯生物技术有限公司，饲养于室温25 ℃，SPF级环境。

1.1.2 药物 本研究使用中药来自南京中医药大学南通附属医院中药房，购自南通三越中药饮片有限公司。养肺控瘤方组成如下：黄芪45 g、生晒参15 g、北沙参30 g、薏苡仁30 g、白花蛇舌草30 g、仙鹤草30 g。药物煎煮成等效剂量（按人鼠体表面积换算为2.43 g/kg，含生药121.5 mg/mL），高劑量组（人等效剂量10倍为24.3 g/kg，含生药1 215 mg/mL），药液放置于4 ℃保存备用。顺铂（20 g/瓶，齐鲁制药有限公司生产，批号：2WA2A1308054A，加0.9%生理盐水溶解并稀释至0.2 mg/mL。

1.1.3 试剂与仪器 10%小牛血清、1640培养基、0.25%胰蛋白酶购自Gibco公司，24孔板（含Transwell小室），购自美国Coming公司，相关ELISA试剂盒购自eBioscience公司。低温冰箱（THERMO Heto ULtra Freeze，美国）；低速台式离心机（TDL-50B，上海安亭科学仪器厂）；D-37520高速冷冻离心机（Thermo，Germany）；LX-100手掌型离心机（LX100 Bio-rad USA）；RF5301PC荧光分光光度仪（Shimadzu，Japan）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将30只小鼠以随机数字表的方法随机分为以下6组：空白对照组；顺铂组；等效剂量中药组；高剂量中药组；顺铂+等效剂量中药组；顺铂+高剂量中药组。将制备的Lewis肺癌细胞株细胞悬液（1×107细胞/mL），在每只小鼠腋后线第6肋间胸腔接种0.1 mL。接种细胞10 d，微型超声提示胸腔种植和胸腔转移，晚期肺癌模型建立成功。

1.2.2 给药方法

空白对照组给予生理盐水灌胃；顺铂组给予顺铂腹腔注射，2 mg/kg，隔天给药；等效剂量中药组给予人等效剂量的养肺控瘤方灌胃（按人鼠体表面积换算为2.43 g/kg）；高等剂量中药组给予人等效剂量10倍的养肺控瘤方灌胃（按人鼠体表面积换算为24.3 g/kg）；顺铂+等效剂量中药组给予顺铂腹腔注射联合人等效剂量的养肺控瘤方灌胃；顺铂+高等剂量中药组给予顺铂腹腔注射联合人等效剂量10倍的养肺控瘤方灌胃。

1.2.3 检测指标与方法

药物干预15 d。接种lewis细胞后25 d，采用摘眼球法取血0.4 mL，离心分离出血清，用酶联免疫吸附试验检测血清的IL-2、TNF-α。IL-2、TNF-α标准品的稀释、加样、加酶、终止和吸光度（A）计算参考文献[6-7]。第25天脱颈处死各组小鼠，剥取肿瘤称取质量。抑瘤率=（1-实验组肿瘤平均质量/空白对照组肿瘤平均质量）×100%。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率表示，比较用χ检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6组抑瘤率比较 与养肺控瘤方组和顺铂组均显示了明显的肿瘤抑制作用。空白对照组与顺铂组、等效剂量中药组、高剂量中药组、顺铂+等效剂量中药组、顺铂+高剂量中药组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。顺铂+等效剂量中药组、顺铂+高剂量中药组与顺铂组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。中西联合组在肿瘤抑制方面优于顺铂组（P<0.05）。顺铂+高剂量中药组与顺铂+等效剂量组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。中药各剂量组差异无统计学意义（P>0.05）。顺铂组的抑瘤作用明显强于单纯中药组（P<0.05）。见表1。

2.2 6组IL-2、TNF-α检测结果比较 除空白对照组外，其余5组IL-2、TNF-α水平均明显下降，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。养肺控瘤方与顺铂联合观察组中，血清IL-2、TNF-α水平与顺铂组比较，也明显下降（P<0.05）。

3 讨论

研究发现，在肺癌细胞周围的微环境和肺癌周围的间叶组织中都发现了大量的细胞因子和炎性细胞[8]，之后的研究也已证明细胞因子介导的慢性炎性反应是肿瘤发生、发展过程中的重要的因素[9]。活化T淋巴细胞产生的IL-2能调节免疫系统，发挥抗肿瘤作用，是人体免疫调节功能的主要细胞因子之一[10]。肿瘤坏死因子（TNF）是一类具有广泛生物学活性的细胞因子，主要由活化的T淋巴细胞和巨噬细胞产生的TNF-α组成[11]。它具有杀灭肿瘤细胞的强大作用，与其他生物因子具有重要的协同作用，是人体质量要的免疫保护递质。在长期的晚期非小细胞肺癌的中西医结合临床实践中，晚晚期非小细胞肺癌的基本证型以肺气亏虚及气阴两虚两型为主，根据“养正积自除”的治疗原则，我科制定了养肺控瘤协定方。治疗当根据“养正积自除”的治疗原则[12]。养肺控瘤方，以生黄芪、生晒参补益肺脾、益气固本，北沙参养阴润肺，薏苡仁、仙鹤草健脾补虚，白花蛇舌草清热解毒散瘤。全方益气养阴，消瘤散结[13]。

实验研究显示，养肺控瘤方具有抑制肿瘤生长作用，其与顺铂联合有协同增效抑瘤作用[14]。抑瘤率方面，各观察组均显示了一定的肿瘤抑制作用。养肺控瘤方与顺铂联合在肿瘤抑制方面优于单纯顺铂组。各观察组对Lewis晚期肺癌小鼠血清IL-2、TNF-α均有不同的降低作用，养肺控瘤与顺铂联合显示了显著的降低炎性反应因子水平的作用。

综上所述，养肺控瘤方能抑制Lewis晚期肺癌小鼠肿瘤生长，并能与顺铂协同降低Lewis晚期肺癌小鼠模型血清IL-2、TNF-α的表达水平，其抑制肿瘤作用机制可能与免疫因素相关。

参考文献

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