基于分子对接的独活寄生汤治痿和治痹药效物质基础研究

【摘 要】目的：探索独活寄生汤治痿和治痹的药效物质基础。方法：构建独活寄生汤化学成分分子数据库，运用分子对接技术，探讨其与软骨退变靶点基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、炎症靶点环氧化酶-2（COX-2）受体的相互作用。结果：独活寄生汤的药效物质基础含有25个化合物，主要为苷类、黄酮类化合物，其中，16个化合物能与MMP-13有较好的作用，14个化合物能与COX-2有较好的作用，5个化合物对MMP-13和COX-2均有作用效应。结论：独活寄生汤可通过MMP-13和COX-2的有效成分群分别起到治痿、治痹或痿痹同治的作用，为其在骨关节炎中的临床运用提供新依据。

【关键词】 骨关节炎；独活寄生汤；治痿；治痹；药效物质基础；分子对接

Molecular Docking Research on Pharmacodynamic Material Basis of Duhuo Jisheng Tang（独活寄生汤）Treating Flaccidity and Bi

ZHENG Chun-song，YAN Pei-jing，FU Chang-long，YE Hong-zhi，WU Guang-wen，LI Xi-hai，LIU Xian-xiang

【ABSTRACT】Objective：To explore the pharmacodynamic material basis of Duhuo Jisheng Tang（独活

寄生汤）treating flaccidity and Bi.Methods：A molecular database of the chemical constituents of Duhuo Jisheng

Tang was established.Molecular docking technology was used to explore its interaction with MMP-13 and COX-2.Results：The material basis for the efficacy of Duhuo Jisheng Tang contained 25 compounds，mainly including glycosides and flavonoids，among which 16 compounds could have a better interaction with MMP-13，

14 compounds could have a better interaction with COX-2，and 5 compounds had interactions with MMP-13 and COX-2.Conclusion：Duhuo Jisheng Tang treats flaccidity and bi by effective components of MMP-13 and COX-2，

which can provide a new basis for its clinical use in osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis；Duhuo Jisheng Tang（独活寄生汤）；treating flaccidity；treating bi；pharmacodynamic

material basis；molecular docking

骨关节炎（osteoarthritis，OA）属中医学“骨痹”“膝痹”范畴，中医药及其相关治疗方法已经成为国内治疗OA的主要手段[1]。笔者前期课题组基于陈可冀学术思想之骨关节炎研究，提出了本痿标痹为OA的核心病机，开展了基于本痿标痹核心病机的OA系列研究，形成了从本治痿、从标治痹的OA治疗理念，该成果获2015年福建省科学技术进步奖一等奖[2]。但是，具体的治痿、治痹药效物质基础研究甚少。

独活寄生汤出自唐代医家孙思邈的《备急千金要方》，由独活、桑寄生、牛膝和细辛等组成，既能祛风湿、止痹痛，又能益肝肾和补气血[3]，临床上可用于治疗OA的痹证和痿证[4]，已被实验证实其具有抗炎镇痛和延缓关节软骨退变的作

用[5-6]。为此，笔者以独活寄生汤为研究对象，借助计算机模拟之分子对接方法[7-9]，寻找独活寄生汤中治痹和治痿疗效发挥的物质基础，从分子层面为OA“本痿标痹”核心病机的中药治疗提供理论支持，也为名方的二次开发和OA的精准治疗提供新依据。

1 材料与设备

1.1 实验材料 独活寄生汤分子集；OA治痹、治痿靶标。

1.2 实验设备 使用北京大学化学与分子工程学院计算机模拟实验室的Discovery Studio（DS）软件进行计算，该软件的运行环境：DS 2.0图形工作站和Microsoft Windows XP Professional，SP 2操作系统。计算模拟过程中所用的参数除非特别指明，否则，均为缺省值。

2 方 法

2.1 独活寄生汤分子数据库的建立 从北京大学中草药有效成分三维结构数据库、中药原植物化学成分手册和文献[10-12]，检索独活寄生汤组成药物（独活、桑寄生、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂、防风、川芎、当归、地黄、杜仲、人参、白芍和甘草）的化学成分（包括代谢成分），经过排重，共计566个中药化学成分。利用美国MDL信息系统公司的ISIS/DRAW 2.5软件绘制其二维结构，输出为mol格式文件。在DS 2.0上加氫，转化为三维结构，应用Ligand Minimination模块对化学成分三维结构进行默克公司开发的分子力场（MMFF）优化，保存为sd文件（DHJSD-bank.sd），建立独活寄生汤分子数据库。

2.2 治痹、治痿靶标的选择 根据OA的发病机制[13-16]、治疗靶数据库（TTD）[17]、软骨退变临床表现为痿、骨质增生临床表现为痹[2]，确定与抗炎镇痛密切相关的治痹靶标环氧化酶-2（COX-2），以及与延缓软骨退变密切相关的治痿靶标基质金属蛋白酶-13（MMP-13）。在RCSB Protein Data Bank上[18]，下载COX-2和MMP-13

的蛋白质晶体结构，其代码分别为3MQE和3I7I，见图1。

2.3 分子对接 独活寄生汤分子集配体与OA靶标的对接工作在DS 2.0中的LigandFit模块进

行[19-20]。对接中，蛋白结构去溶剂、去配体、加氢处理后，以其所含的活性原配体来确定活性位

点；在“Input Ligands”中输入DHJSD-bank.sd文件。使用蒙特卡罗方法对独活寄生汤化学成分配体进行构象采样、Dreiding力场下进行打分，保留得分最高的构象。对对接成功配体化合物的DOCK-SCORE进行排序[9]，寻找比原配体DOCK-SCORE高的化合物，视为独活寄生汤的药效成

分[21-22]，从而得到独活寄生汤中治痹和治痿药效物质基础。

3 结 果

3.1 基于MMP-13和COX-2的分子对接 在DS的Ligandfit模块中，遵循能量互补、几何互补以及化学环境互补等原则，得到各自最佳的DOCK-SCORE。以已知的配体抑制剂DOCK-SCORE为阈值，发现独活寄生汤潜在的活性成分25个，其中，与MMP-13结合较好的化合物16个，分别为异洋丁香酚苷、新异甘草苷、甘草宁E、朝鲜连翘苷、乌拉尔宁、异芒果花苷、异甘草苷、叶酸、乌拉尔醇-3-甲基醚、乌拉尔醇、绿原酸甲酯、西北甘草异黄酮、绿原酸、乌拉尔甘草皂苷B、乌拉尔甘草皂苷A和4"-O-甲基光甘草定；与COX-2结合较好的化合物14个，分别为新西兰牡荆苷Ⅱ、烏拉尔宁、异槲皮苷、乌拉尔醇-3-甲基醚、乌拉尔醇、异甘草黄酮醇、京尼平苷酸、甘草香豆精、乌拉尔甘草皂苷A、乌拉尔甘草皂苷B、芍药苷、芍药吉酮、乌拉尔甘草皂苷A甲基正丁酯和3"-甲氧基光甘草定。

3.2 独活寄生汤化学成分治痿和治痹的综合评价 以比原配体DOCK-SCORE高的化合物视为独活寄生汤的药效物质基础。以MMP-13为靶点的治痿药效物质基础与以COX-2为靶点的治痹药效物质基础主要由苷类、黄酮类成分组成。其中，有5个化合物能同时作用MMP-13和COX-2，但有11个化合物仅能跟MMP-13存在作用效应，有9个化合物仅能跟COX-2存在作用效应。说明独活寄生汤药效物质基础在一定程度上显示出治痿和治痹既有各自独立的药效成分，又有共同的药效成分。独活寄生汤化学成分治痿和治痹的综合评价见表1。

4 讨 论

目前，国内科研人员常采用活性追踪分离法从中药中筛选活性化合物；但往往分离到的物质越

纯，其药效活性越弱，难以追踪到药效物质，相应的作用靶点也难以阐明[23]。近年来，随着结构生物学、系统生物学、计算化学及分子模拟等学科的发展，开展计算机辅助药物设计（CADD），已经成为一种国际上热点的研究领域。其方法已被国内外许多制药公司、研究机构用于新药、中药的研究与开发，并取得了极大的成功[24-25]。其中，CADD中的分子对接，是中药复方药效物质基础的高效快速虚拟筛选最常见的技术之一[26-27]。因此，本文将分子对接方法用于独活寄生汤复方药效物质基础的研究。

OA是以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的一种慢性关节病，是导致中老年人疼痛和残疾的最常见原因[28]。其治疗目的是缓解关节疼痛，改善功能并重建受损的软骨及骨的结构。其中，缓解关节疼痛常用COX-2抑制剂，其作用机制是通过抑制COX-2的活性，阻断花生四烯酸和缓激肽等致痛物质的代谢，防止血管性前列腺素的合成达到抗炎镇痛的作用[29]。另外，已有研究表明，OA软骨细胞外基质的降解超过其合成，导致软骨基质净含量的降低，进而造成关节软骨的部分甚至完全损耗，是关节软骨破坏的主要病理表现[30]。而MMP-13可使Ⅱ型胶原变性裂解，对关节软骨细胞外基质具有降解作用，引起关节软骨肿胀，抗外力作用下降，最终导致关节软骨进行性破坏[31]。因此，COX-2和MMP-13已成为缓解疼痛和延缓软骨退变的重要靶点。

笔者课题组认为，OA以关节软骨退变为原发、骨质增生为继发的病理特点，关节软骨退变临床表现为痿，骨质增生临床表现为痹，本痿标痹为OA的核心病机[2]。治疗上应本着整体观念和病证结合的原则，客观地辨证分析。从本治痿，从标治痹，急则治痹痛，缓则治痿证，久则痿痹同治。这里的治痹、治痿与缓解疼痛、延缓软骨退变相互对应起来。而且，从中医角度看，OA的“本痿标痹”是以肝肾亏虚为本，以风寒湿为标[32]。说明祛风湿、益肝肾作为治疗OA的根本法则，且具有祛风湿、止痹痛、益肝肾和补气血功效的独活寄生汤可起到治痿和治痹的作用。王爱武等[33]进行了独活寄生汤抗炎、镇痛的药效学研究，进一步证实了其治痹作用。原巧宁等[34]进行独活寄生汤治疗大鼠膝OA软骨病理学分析，证实了其能延缓关节软骨的退行性病变，即具有治痿作用。因此，笔者分别以MMP-13和COX-2为治痿、治痹靶点，以独活寄生汤为研究对象，借助分子对接平台，开展其治痿和治痹的药效物质基础研究。

本实验研究发现，独活寄生汤中黄酮类（乌拉尔宁、甘草宁E等）、苷类（新异甘草苷、异甘草苷等）、有机酸类（叶酸和绿原酸）等化合物可能通过抑制MMP-13活性达到延缓软骨退变治痿的目的；黄酮类（异槲皮苷、异甘草黄酮醇等）、苷类（新异甘草苷、异甘草苷等）、有机酸类（京尼平苷酸）等化合物可能通过抑制COX-2活性达到抗炎治痹的目的。文献已报道，叶酸可以降低MMPs的活性，绿原酸对高强度跳跃运动引发的膝关节软骨损伤具有一定的保护作用，异槲皮苷和京尼平苷酸具有抗炎的作用等[35-38]。提示独活寄生汤治痿和治痹的药效物质基础均是有效成分群。由于中药具有多靶点的作用特点[21]，本研究也发现乌拉尔宁、乌拉尔醇-3-甲基醚、乌拉尔醇、乌拉尔甘草皂苷A和乌拉尔甘草皂苷B既能作用于COX-2，又能作用于MMP-13。这些潜在的“混杂药物”显示出独活寄生汤痿、痹同治的特点。上述为独活寄生汤治疗OA提供了依据。

总之，分子对接的方法用于独活寄生汤治痿和治痹的药效物质基础研究是一个有益的尝试。如何在这方面进行更广、更深的研究，如构建治痿和治痹的中药治疗网络等，是未来值得我们思索的问题。相信CADD之分子对接有助于推动OA的中药现代化进程。

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收稿日期：2016-09-12；修回日期：2016-11-16

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