我国北方玉米上平脐蠕孢属和弯孢属真菌及其所致叶斑病

摘要

平脐蠕孢属（Bipolaris）和弯孢属（Curvularia）真菌可引起多种玉米叶斑病。为了解当前玉米生产上此类病害的发生情况，2014年8-9月对我国玉米主产区北京、河北、河南、黑龙江和吉林5省市玉米上疑似由该两属真菌引起的叶部病斑样品进行了采集，随后进行了真菌的分离和鉴定。共采集样品42份，根据其形状特点归为4类：长条形、椭圆形、小点状和梭形病斑。经组织分离获得平脐蠕孢属和弯孢属真菌28株，基于形态学和rDNAITS序列的系统发育分析共鉴定出5个种：玉蜀黍平脐蠕孢（B.maydis）、玉米平脐蠕孢（B.zeae）、玉米生平脐蠕孢（B.zeicola）、新月弯孢（C.lunata）和穂状弯孢（C.spicifera）。从长条形病斑和椭圆形病斑上分离到的主要是B.maydis和B.zeicola，从小点状病斑分离到的主要是C.lunata，其次是B.zeae。分离出C.lunata的样品病斑较为稀疏、颜色略浅、呈苍白色，分离出B.zeae的样品病斑更为密集、颜色较深。从梭型病斑分离到的是C.spicifera。有少数样品可分离到上述两种菌。采用孢子悬浮液喷雾法对温室玉米苗接种，上述5种真菌均可致病。以接种B.maydis发病最快，发病最重；接种B.zeicola、C.lunata 或C.spicifera发病较慢，症状明显；接种B.zeae发病最慢，仅引起小点状病斑。研究结果可为玉米叶斑病的正确诊断提供资料和依据。

关键词

玉米； 叶斑病； 诊断； 平脐蠕孢； 弯孢

玉米是我国重要的粮食、饲料和经济作物，种植面积位居禾谷类作物之首，每年播种面积在3 000万～3 067万hm2，在农业生产和国民经济发展中占据重要地位[1]。平脐蠕孢属（Bipolaris Shoemaker）和弯孢属（Curvularia Boedijn）的多种真菌都是禾本科植物上的重要病原菌，主要引起叶斑病[23]。在玉米上常见的有引起玉米小斑病的玉蜀黍平脐蠕孢（B.maydis）、引起玉米圆斑病的玉米生平脐蠕孢（B.zeicola）和引起玉米弯孢叶斑病的新月弯孢（C.lunata）[46]。

玉米小斑病和玉米圆斑病的病原菌同属于平脐蠕孢属，田间病害特征也有很多相似之处，有报道统称为“小型叶斑病”[7]，主要危害玉米叶部，也可侵染叶鞘、苞叶，玉米叶片上的病斑常较小且密集，病斑形状大多呈椭圆型、长方形或梭形，发病严重时，病斑可连在一起形成大面积的坏死叶斑。另外，玉米小斑病菌不同的生理小种在各抗病品种上引起的病斑也有较大差异[8]。近年来，弯孢属真菌引起的玉米弯孢叶斑病在我国各大玉米产区均有发生，已成为危害玉米生产的重要病害之一。玉米弯孢叶斑病主要侵染玉米叶片，病斑圆形、较小，直径1～4 mm，呈灰白色，边缘具有黄色晕圈，有时多个圆形病斑扩展成长方形，可长达 1 cm，形成类似于小斑病的长方形病斑，发病严重时病斑密布叶片，使叶片枯死[910]。

由于田间玉米叶片发病症状的复杂性和多样性，仅通过叶斑的症状有时难以判断病原菌的种类。Schoch等[11]提出以rDNA ITS作为真菌界的DNA条形码，以利于真菌多型分类、生态学和生物多样性的研究。近几年国内外学者对平脐蠕孢属和弯孢属真菌分子系统学的研究有了不少进展[1214]，为该两属真菌的准确鉴定奠定了基础。田间植物病害的发生是动态变化的，为了解当前引起玉米叶斑病害的平脐蠕孢属和弯孢属真菌的种类和发生情况，2014年我们对我国玉米主产区5省市进行了玉米叶斑类病害样品的采集和分离，对分离获得的菌株进行形态学观察和rDNA ITS序列系统发育分析，本文报道了平脐蠕孢属和弯孢属真菌的相关研究结果，为认识和鉴别玉米叶斑病害及其病原真菌种类提供参考。

1 材料与方法

1.1 病害样品采集

2014年8-9月分别对北京、河北、河南、黑龙江、吉林5省市的玉米田叶斑病发病叶片进行采集，在采集过程中现场拍摄症状照片并记录采集地点、日期、采集地生境和采集人姓名等样品信息。

1.2 病原真菌的分离保藏

采用组织分离法对采集的样品进行病原真菌的分离。从叶片发病部位的病健交界处切取0.5 cm左右见方的组织块，浸入75%乙醇消毒30 s～1 min，无菌水冲洗3次，移至PDA平板上，每平板上均匀放4块组织块，每个病斑样品分离2个平板，于25℃恒温箱中培养。待菌落长出后，从组织块菌落边缘挑取少量菌丝，移入PDA平板上纯化培养，将纯化菌株保藏备用。

1.3 病原真菌的形态学观察

将菌株接种在PDA培养基上，待长满大半个平皿后用打孔器在菌落边缘打5 mm菌饼，将菌饼接种到水琼脂麦秆培养基上，定期观察菌株的菌落形态、颜色和生长速度。培养14 d左右菌落产孢后在显微镜下观察分生孢子梗形态以及分生孢子在分生孢子梗上的着生状态，测量分生孢子和分生孢子梗的大小。

1.4 菌株DNA提取、PCR扩增及ITS序列测定

将菌株接种到PDA平板上，25℃培养，待长满平板时刮取菌丝，用混合式研磨仪（Retsch MM400）破碎菌丝后，采用KingFisher Duo磁珠纯化系统和Fisher Scientific公司的试剂盒（LabServ_24）进行DNA提取。用引物ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）和ITS5（5′GAAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3′）对提取的DNA进行rDNAITS区域的PCR扩增[15]，扩增产物经检测后送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。

1.5 基于rDNAITS的系统发育分析

将测得的rDNAITS序列提交GenBank，根据相关文献从GenBank下载参照菌株的rDNA ITS序列信息[1214，16]。将所有的rDNAITS序列经软件Clustal X进行对齐后[17]，采用MEGA 6.0软件中的neighborjoining （NJ）法构建系统发育树[1819]。

1.6 致病性测定

每个真菌种选择一株代表性菌株进行致病性测定。在温室中种植玉米‘中昌158’，待长至6～7叶期用于接种。预先将纯化后的菌株接种到水琼脂麦秆培养基或PDA平板上，25℃条件下培养使菌株产孢。用含0.1%吐温-80的无菌水将孢子从平板上洗脱，双层纱布过滤，配制成浓度为1×105～1×106个/mL的孢子悬浮液。采用喷雾法接种，每株菌接种玉米植株6株，接种量为30 mL/株，以含0.1%吐温-80的无菌水作对照。玉米植株接种后于30℃密闭保湿24 h，取出后置于温室培养（白天33～35℃，夜间25～27℃）。每天观察记载植株发病情况，接种14 d后取发病玉米叶片进行组织分离并对再分离的病菌进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 玉米叶斑病害样品的采集及整理

从5省市共采集疑似由平脐蠕孢属和弯孢属真菌引起的叶斑病样品42份。根据病斑特征将这42份样品大致分成4类，其中长条形病斑17份，5省市都有；椭圆形病斑12份，采自除黑龙江外的其他4省市；小点状病斑9份，采自北京、河北和黑龙江3省市；梭形病斑4份，采自北京、河南和吉林3省市。

2.2 平脐蠕孢属和弯孢属分离菌株的系统发育关系分析

42份叶斑病样品有24份分离到平脐蠕孢属和弯孢属真菌共28株，其中有4份样品各分离到2株。分离到的28株真菌及其rDNAITS序列信息见表1。

选取Alternaria alternata CBS916.96和Drechslera avenacea DAOM208989作为外群与参照菌株序列一起构建系统发育树。系统发育树分成平脐蠕孢属和弯孢属两个大的分支，本研究分离获得的菌株分别与5个种的模式菌株或参照菌株稳定聚在相同分支上，支持率均大于50%（图1）。

平脐蠕孢属的7个菌株ACCC38959、ACCC38960、ACCC38961、ACCC38962、ACCC38963、ACCC38964、ACCC38965与B.zeicola的参照菌株 FIP532完全聚类到一个分支上且支持率为63%；2个菌株ACCC38957、ACCC38958与B.zeae的模式菌株BRIP11512在一个进化支上，支持率为54%；9个菌株ACCC38948、CCC38949、ACCC38950、ACCC38951、ACCC38952、ACCC38953、ACCC38954、ACCC38955、ACCC38956与B.maydis的模式菌株CBS13629及参照菌株CBS137271聚类到一起，支持率为87%（图1）。

弯孢属的4个菌株ACCC38972、ACCC38975、ACCC38976、ACCC38977与C.spicifera的模式菌株JN192387聚类到同一分支上，并且支持率为91%；6个菌株ACCC38966、ACCC38967、ACCC38968、ACCC38969、ACCC38970、ACCC38971与C.lunata的模式菌株CBS73096聚类到一起，且支持率为97%（图1）。

2.3 引起玉米叶斑病的平脐蠕孢属和弯孢属5个种的形态学鉴别

平脐蠕孢属与弯孢属系统发育关系相近，形态上有一些相似之处，但它们存在明显区别，主要在分生孢子的大小、形态和假隔膜数这3个方面。平脐蠕孢属真菌的分生孢子较大、长度一般在30 μm以上，直立或略有弯曲，假隔膜数目通常超过4个；弯孢属真菌分生孢子较小，多数因中间细胞不对称膨大产生弯曲，少数没有膨大的中间细胞而呈直立形（图2）。

与B.zeae和B.zeicola相比，B.maydis分生孢子颜色较浅、有明显弯曲，分生孢子的宽度平均为15.1 μm，而B.zeae和B.zeicola分生孢子宽度均不超过14 μm，分生孢子平均宽度小于13 μm。B.zeicola和B.zeae的分生孢子颜色均较深且弯曲不明显，其中B.zeicola分生孢子较短，平均48.3 μm×12.7 μm，中间的细胞宽于两端，基细胞钝圆（图2h）；B.zeae分生孢子较长，平均73.2 μm×12.9 μm，梭形或倒卵形（图2f）。C.lunata与C.spicifera 分生孢子的主要区别是，C.lunata 分生孢子基部第三个细胞膨大使孢子弯曲，分生孢子顶端粗而钝，基部细而尖（图2j，k）；C.spicifera的分生孢子正直，呈椭圆形（图2m，n）。

2.4 不同叶斑类型的病原菌种类分析

经对不同玉米叶斑类型和分离到的平脐蠕孢属和弯孢属真菌种类进行统计和分析，采集的17份长条形病斑样品中有5份分离到B.maydis、4份分离到B.zeicola，其中2份样品D14037和D14041都同时分离到了B.maydis和B.zeicola。采集的12份椭圆形病斑样品中有4份分离到了B.maydis、3份分离到了B.zeicola和1份分离到了C.lunata，其中样品D14032同时分离到了B.maydis和B.zeicola，样品D14042同时分离到了B.zeicola和C.lunata。采集的9份小点状病斑样品中有5份分离到了C.lunata、有2份分离到了B.zeae。仔细比较分离到B.zeae和C.lunata的样品病斑特征发现，B.zeae引起的小点状病斑更为密集，病斑颜色较深；C.lunata引起的病斑较为稀疏，颜色略浅，呈苍白色（图3）。采集的4份梭形病斑样品全都分离到了C.spicifera（表2）。

2.5 分离菌株的致病性

接种B.maydis的植株发病较快，接种48 h后就隐约可见叶片有褪色斑点，随着病情发展，3 d后小斑点连成片导致叶片大面积枯死。接种B.zeicola、C.lunata 和C.spicifera的植株都在接种4 d后出现明显病斑，而接种B.zeae的植株在接种7 d后叶部才出现褪绿小点。对照组玉米植株除了底层叶片有正常变黄外，未见发病。采集发病叶片，进行再次分离，均分离到与接种病原菌一致的真菌，证明了它们的致病性。

3 结论与讨论

经对我国北方5省市田间发生的疑似由平脐蠕孢属和弯孢属真菌引起的玉米叶斑病害进行采集和病菌的分离鉴定，共鉴定到该两属真菌5种，即B.maydis、B.zeicola、B.zeae、C.lunata和C.spicifera。根据各种真菌分离到的频率判断，条形和椭圆形病斑主要由B.maydis和B.zeicola引起，即主要为玉米小斑病和圆斑病。小点状病斑主要由C.lunata引起，即玉米弯孢叶斑病为主，B.zeae引起的叶斑病次之。从症状上看，C.lunata引起的小点状病斑较为稀疏、颜色略浅、呈苍白色，而B.zeae引起的点状病斑更为密集、颜色较深。梭形病斑主要由C.spicifera引起。试验中有少量样品同时分离到了上述5种中的2种真菌，说明有混合侵染的情况。

B.maydis和B.zeicola分别作为玉米小斑病和玉米圆斑病的病原菌，相关研究已有很多报道。玉米平脐蠕孢（B.zeae）主要寄生在小麦、玉米和一些禾本科杂草上[3]，国内有报道从陕西杨凌玉米上分离到B.zeae[20]。本研究从黑龙江省甘南县采集的玉米叶斑样品中也分离到B.zeae，温室接种只在玉米叶片引起褪绿小点，说明该菌致病性可能较弱。

国际上报道弯孢属有8个种能引起玉米叶斑病，我国常见的有C.lunata，C.pallescens，C.eragrostidis，C.clavata，C.intermedia，C.inaequalis 6种[2123]。本研究采集的样品中弯孢属分离到2个种C.lunata和C.spicifera，C.lunata作为玉米弯孢叶斑病的主要病原菌已有很多报道；而C.spicifera是一个广布种，在空气、土壤和多种禾本科植物上都有分布[3]，耿月华等[24]报道河南郑州周边地区玉米田土壤中分离到了穗状平脐蠕孢（B.spicifera），即C.spicifera[12]，但尚未见引起玉米叶斑病害的报道。本研究分离到C.spicifera的样品病斑大多呈梭形，与玉米大斑病（Exserohilum turcicum）引起的病斑形状相似，但C.spicifera引起的叶斑较小，也没有大斑病那样的很大的长条斑。温室接种试验中C.spicifera在玉米叶片上引起小点状病斑，没有田间的病斑大，也可能与玉米品种、生育期和温湿度等因素有关，其致病性和在田间的发生情况值得进一步研究。

平脐蠕孢属和弯孢属真菌严重危害我国玉米的种植生产[25]。除了常见的玉米小斑病、玉米圆斑病和玉米弯孢叶斑病外，该两属真菌的其他类群引起的玉米叶斑病害也有零星报道[20， 24， 26]。该两属真菌引起玉米病斑复杂多样，存在同一病原引起的症状差别很大和不同病原引起相似症状的特点，同时还存在二者混合发生的情况。因此，仅通过叶斑的症状有时难以判断病原菌的种类。本研究通过对玉米不同类型叶斑的病原菌进行分离和鉴定，明确了发生于我国北方玉米上的平脐蠕孢属和弯孢属的主要真菌种类及其所致病斑特点，为此类病害的正确诊断提供了依据和资料。

参考文献

[1] 王晓鸣， 石杰， 晋齐鸣， 等. 玉米病虫害田间手册[M]. 北京： 中国农业科学技术出版社， 2010： 1324.

[2] Drechsler C.Phytopathological and taxonomic aspects of Ophiobolus， Pyrenophora， Helminthosporium and a new genus， Cochlioblus [J]. Phytopathology， 1934， 24（9）： 953983.

[3] Sivanesan A.Graminicolous species of Bipolaris， Curvularia， Drechslera， Exserohilum and their teleomorphs [M]. Oxford： CAB International Mycological Institute， 1987： 1263.

[4] 姜广正. 中国禾本科植物上的蠕形菌（Helminthosporium）[J]. 植物病理学报， 1959， 5（1）： 2134.

[5] 刘国胜. 玉米蠕孢类病菌生理分化研究的历史与现状[J]. 河北农业大学学报， 1993， 16（3）： 99103.

[6] Manamgoda D S， Cai L， Bahkali A H， et al. Cochliobolus： an overview and current status of species [J]. Fungal Diversity， 2011， 51（1）： 342.

[7] 刘露. 雅安市玉米叶斑病的危害及小型叶斑病的病原研究[D]. 雅安： 四川农业大学， 2012.

[8] 罗畔池， 刘克明，杨明漪，等. 我国玉米小斑病菌的生理小种[J]. 植物病理学报， 1981， 11（3）： 4956.

[9] 李富华， 王玉涛， 潘开文. 玉米弯孢叶斑病研究现状、问题与展望[J]. 植物保护， 2004， 30（6）： 510.

[10]赵来顺， 田学军， 李玉琴， 等. 玉米黄斑病研究I·病原菌鉴定[J]. 河北农业大学学报， 1995， 18（2）： 4345.

[11]Schoch C L， Seifert K A， Huhndorf S， et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer （ITS） region as a universal DNA barcode marker for fungi [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2013， 109（16）： 62416246.

[12]Manamgoda D S， Cai L， McKenzie E H C， et al. A phylogenetic and taxonomic reevaluation of the BipolarisCochliobolusCurvularia complex [J]. Fungal Diversity， 2012， 56（1）： 131144.

[13]Tan Y P， Madrid H， Crous P W， et al. Johnalcornia gen. et. comb. nov.， and nine new combinations in Curvularia based on molecular phylogenetic analysis [J]. Australasian Plant Pathology， 2014， 43（1）： 589603.

[14]Manamgoda D S， Rossman A Y， Castlebury L A， et al. The genus Bipolaris [J]. Studies in Mycology， 2014， 10（2）： 168.

[15]White T J， Bruns T， Lee S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics [M]∥Innis M A， Gelfand D H， Sninsky J J， et al. PCR Protocols： A Guide to methods and applications.San Diego：Academic Press，1990：315322.

[16]Berbee M L， Pirseyedi M， Hubbard S.Cochliobolus phylogenetics and the origin of known， highly virulent pathogens， inferred from ITS and glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase gene sequences [J]. Mycologia， 1999， 91（6）： 964977.

[17]Thompson J D， Gibson T J， Plewniak F， et al. The CLUSTAL_X windows interface： flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools [J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（24）： 48764882.

[18]Saitou N， Nei M. The neighborjoining method： a new method for reconstructing phylogenetic trees [J].Molecular Biology and Evolution， 1987， 4（4）： 406425.

[19]Tamura K， Stecher G， Peterson D， et al. MEGA6： molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 [J]. Molecular Biology and Evolution， 2013， 30（12）： 27252729.

[20]孙广宇， 张天宇. 离蠕孢属1新种和7个国内新记录[J]. 西北农业大学学报， 1992， 20（4）： 8486.

[21]Shurtleff M C.Compendium of corn diseases [M]. 2nd Edition. Minnesota： American Phytopathological Society， 1980：103105.

[22]石洁， 刘玉瑛， 魏利民. 玉米弯孢菌叶斑病病原菌的研究[J]. 沈阳农业大学学报， 2000， 31（5）： 479481.

[23]戴法超， 高卫东， 王晓鸣. 玉米弯孢菌叶斑病的初步研究简报[J]. 植物保护， 1998， 22（4）： 3637.

[24]耿月华， 张猛， 李跃. 河南郑州玉米田 4 种暗色丝孢真菌的鉴定[J]. 安徽农业科学， 2014， 42（13）： 38843886.

[25]吕国忠， 陈捷， 白金铠， 等. 我国玉米病害发生现状及防治措施[J]. 植物保护， 1997， 23（4）： 2021.

[26]黄世臣， 赵敏. 1株产胆红素氧化酶新菌株的分离与鉴定研究[J]. 安徽农业科学， 2014， 42（12）： 34863490.

（责任编辑：田 喆）

推荐访问:叶斑病 真菌 所致 玉米 我国