山东蓬莱葡萄灰霉菌对7种杀菌剂的抗药性检测

对照。使用前先将97%抑霉唑原药溶解于适量甲醇配成20 mg/mL的母液并置于4℃储存待用，试验时按设置浓度稀释，加入到熔化后冷却至50℃左右的PDA培养基中，并根据溶剂含量不得超过培养基总体积的0.5%的标准进行试验。将分离纯化并保存在-80℃的69株灰霉菌活化培养3 d后沿菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼接种到含药PDA平板中央，以不加药的空白PDA平板做对照，每次处理重复3次，置于22℃培养3 d左右，对照组菌落直径达到平板的3/4左右时，用十字交叉法测量菌落直径，利用SPSS 19.0软件计算出抑霉唑对各菌株的EC50。

1.4葡萄灰霉菌对不同杀菌剂的抗药性

采用菌丝生长速率法和孢子萌发法检测葡萄灰霉病菌对多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、啶酰菌胺和嘧霉胺的抗性频率[14]，根据Bardas等[14]、Myresiotis等[15]的方法，设置多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、啶酰菌胺和嘧霉胺的最小抑制浓度分别为10、5、5、1、5、1 μg/mL。其中多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、嘧霉胺抗药性测定采用菌丝生长速率法。待熔化完全的PDA培养基冷却至50℃加入定量的药剂，制成含药的PDA平板，并设置不含药剂的空白对照。用直径为5 mm打孔器打取活化的灰霉菌株菌落边沿的菌饼，将菌饼菌丝面朝下接种在含药的平板上，置于22℃光照培养箱中培养3 d，观察菌丝生长状况。灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性频率采用孢子萌发法进行测定：吸取事先制备好的孢子悬浮液均匀涂布在含药WA平板上，22℃培养8～12 h后用显微镜观察孢子的萌发情况。在空白培养基上长势良好，不能在含药培养基上生长或萌发的菌株为敏感菌株，而能在含药培养基上生长或萌发的菌株为抗性菌株。统计敏感和抗性菌株的数量，计算抗性频率。

1.5葡萄灰霉菌对抑霉唑及不同作用机制杀菌剂间的交互抗性

采用菌丝生长速率法测定69株灰霉菌株对多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、嘧霉胺的敏感性;采用孢子萌发法测定各菌株对啶酰菌胺的敏感性，设置空白对照。其中使用菌丝生长速率法测定抗药性时，将活化好的菌株打制菌饼接种在含药培养基平板上，22℃培养3 d左右，待对照组菌落直径达到平板的3/4左右后采用十字交叉法测量菌落直径;孢子萌发法则是22℃培养8 h左右，显微镜下随机取3个视野观察100个孢子的萌发数量，计算萌发率。每个处理重复3次。利用SPSS 19.0软件计算出多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、嘧霉胺、啶酰菌胺对各菌株的EC50。利用SPSS 19.0软件分析抑霉唑对供试菌株的lgEC50分别与多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、嘧霉胺和啶酰菌胺对供试菌株的lgEC50之间的皮尔逊相关性。根据皮尔逊相关系数和显著性来判断两种杀菌剂之间是否存在交互抗性。

2结果与分析

2.1葡萄灰霉菌对不同杀菌剂的抗药性

69株葡萄灰霉菌中抗啶酰菌胺（BosR）、多菌灵（CarR）、咯菌腈（FluR）、异菌脲（IprR）、嘧霉胺（PyrR）、腐霉利（ProR）的比例分别为100%、100%、9.47%、97.18%、100%、89.20%（图1），表明测试菌株已对多菌灵、啶酰菌胺、嘧霉胺产生了完全的抗药性，对腐霉利和异菌脲产生了严重的抗药性，而对咯菌腈的抗性仍较低。对葡萄灰霉菌对这6种杀菌剂的多药抗性分析结果（图2）显示，这69株葡萄灰霉菌株的抗性类型中不存在单抗类型，全部表现为多药抗性，其中BosR_CarR_PyrR（抗啶酰菌胺、多菌灵、嘧霉胺）， BosR_CarR_IprR_PyrR（抗啶酰菌胺、多菌灵、异菌脲、嘧霉胺）， BosR_CarR_FluR_IprR_PyrR （抗啶酰菌胺、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、嘧霉胺），BosR_CarR_IprR_PyrR_ProR和 BosR_CarR_FluR_IprR_PyrR_ProR（抗啶酰菌胺、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、嘧霉胺、腐霉利）的頻率分别为2.33%， 9.30%，2.33%，79.07%，6.97%，数据显示山东蓬莱地区的葡萄灰霉菌菌群的多药抗性类型中以抗啶酰菌胺、多菌灵、异菌脲、嘧霉胺、腐霉利这5种杀菌剂的菌株为主。

2.2抑霉唑对葡萄灰霉菌的EC50测定

采用菌丝生长速率法测定了69株野生葡萄灰霉菌对抑霉唑的敏感性，抑霉唑对各菌株的EC50最高达28.76 μg/mL，最低为0.403 μg/mL，不呈连续性单峰分布，使用SPSS软件进行W法正态性检验，得到W=0.833，P=0.018，P<0.05，说明供试的69株葡萄灰霉菌对抑霉唑的敏感性频率分布不符合正态分布（图3）。其平均EC50为（9.34±10.34）μg/mL。

2.3葡萄灰霉菌对抑霉唑和6种杀菌剂的交互抗性

将抑霉唑对69株葡萄灰霉菌的EC50分别与多菌灵、腐霉利、异菌脲、啶酰菌胺、咯菌腈及嘧霉胺的EC50的对数值运用SPSS软件进行皮尔逊相关性分析，其皮尔逊相关系数r分别为0.049（P>0.05）、0.025（P>0.05）、0.116（P>0.05）、0.134（P>0.05）、0.120（P>0.05）、0.017（P>0.05），数据显示抑霉唑对葡萄灰霉菌的EC50与其他6种类型杀菌剂EC50的相关性均未达到显著水平，表明抑霉唑与多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈、啶酰菌胺及嘧霉胺之间均不存在交互抗性（图4）。

3结论与讨论

3.1葡萄灰霉菌对6种杀菌剂的抗药性

2014年日本大阪地区温室番茄灰霉菌对多菌灵、异菌脲的抗性频率分别到达了74.2%、86.4%[3]，2015年中国浙江地区草莓灰霉菌对腐霉利、嘧霉胺的抗性频率分别达到了69.2%、93.7%[4]，2017年德国东南部树莓灰霉菌对咯菌腈、啶酰菌胺的抗性频率均高达100%[5]。这些数据说明，杀菌剂的长时间和大剂量使用，国内外的灰葡萄孢均已经产生了普遍的抗药性，由此导致的杀菌剂防效下降的现象也日益严重。因此为减少灰霉病害引起的经济损失，科学合理地使用杀菌剂已成为葡萄以及其他经济作物生产上的迫切要求。

本研究表明，山東蓬莱地区葡萄灰霉菌对多菌灵、啶酰菌胺、嘧霉胺、腐霉利、异菌脲、咯菌腈均产生了抗药性且抗性频率分别为100%、100%、100%、89.20%、97.18%和9.47%，表明啶酰菌胺、多菌灵、嘧霉胺对测试葡萄菌株完全丧失防效，建议在该葡萄产区停止使用这些药剂，腐霉利、异菌脲对测试菌株的抗性频率高，建议采取限制使用、禁止单独使用等措施，测试菌株对咯菌腈的抗性频率较低，可以继续使用但需按照科学使用规则进行。

3.2葡萄灰霉菌对6种杀菌剂的多重抗药性

目前，国内外已经有很多关于灰霉病菌对多菌灵、腐霉利、异菌脲、啶酰菌胺、咯菌腈及嘧霉胺的多药抗性的报道[1618]，但是关于葡萄灰霉菌对主要杀菌剂的多重抗药性（以下简称多药抗性）的报道还较少。本研究结果表明，葡萄灰霉菌对上述杀菌剂的抗性类型中不存在单抗类型而全部表现为多药抗性，其中测试菌株对啶酰菌胺、多菌灵、异菌脲、嘧霉胺和腐霉利的多药抗性所占比例最高，达79.07%，但由于无法对该地区杀菌剂的使用情况进行准确的统计，有关于抗性的发展和杀菌剂的使用量间是否存在相关性的研究无法展开。

3.3葡萄灰霉菌对抑霉唑和6种杀菌剂的交互抗性

本研究是首次关于葡萄灰霉菌对抑霉唑和其他6种杀菌剂交互抗性情况的研究。测定了葡萄灰霉菌对抑霉唑的EC50，并对结果进行了统计分析。结果表明，抑霉唑与多菌灵、腐霉利、异菌脲、咯菌腈啶酰菌胺及嘧霉胺之间均不存在交互抗性。在实际葡萄生产中，抑霉唑主要用于储存期病害的控制，与上述6种杀菌剂的使用时间是不同的，且经过试验得出抑霉唑与上述药剂不存在交互抗性，故其可以继续作为葡萄储藏期的保鲜剂，且咪唑类的其他药剂也可继续沿用。另外，如何通过药剂的科学使用来减少葡萄灰霉菌对常用杀菌剂的交互抗性也是科研工作者需要去深入研究的方向。

参考文献

[1]DEAN R， VAN KAN J A， PRETORIUS Z A， et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology [J]. Molecular Plant Pathology， 2012， 13（4）： 804.

[2]张玮，乔广行，黄金宝，等. 中国葡萄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性检测[J]. 中国农业科学，2013， 46（6）： 12081212.

[3]RODRGUEZ A， ACOSTA A， RODRGUEZ C . Fungicide resistance of Botrytis cinerea in tomato greenhouses in the Canary Islands and effectiveness of nonchemical treatments against gray mold [J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology， 2014， 30（9）：23972406.

[4]尹大芳. 浙江省草莓灰霉病菌抗药性检测及抗性机制的研究[D]. 杭州：浙江大学， 2015.

[5]SABRINA R ， WEBER R W S ， DANIEL R ， et al. Spread of Botrytis cinerea strains with multiple fungicide resistance in German horticulture[J]. Frontiers in Microbiology， 2017， 7：2075.

[6]MADE W. Synergism and antagonism in fungicide mixtures containing sterol demethylation inhibitors[J]. Phytopathology， 1996， 86： 12801283.

[7]GREENBERG R， C RESNICK C. A gas liquid chromatographic method for determining imazalil residues in citrus fruit[J]. Pest Management Science， 2010， 8（1）： 5964.

[8]BUS V G. ED50 levels of Penicillium digitatum and P. italicum with reduced sensitivity to thiabendazole， benomyl and imazalil [J]. Postharvest Biology & Technology， 1992， 1（4）： 305315.

[9]BUS V G， BONGERS A J， RISSE L A. Occurrence of Penicillium digitatum and P. italicum resistant to benomyl， thiabendazole， and imazalil on citrus fruit from different geographic origins [J]. Plant Disease， 1991， 75： 10981100.

[10]ZHU Jinwen， XIE Qingyun， LI Hongye. Occurrence of imazalil resistant biotype of Penicillium digitatum in China and the resistant molecular mechanism [J]. Journal of Zhejiang University Science A， 2006， 7（2）： 362365.

[11]WIGLER P W， PATTERSON F K. Inhibition of the multidrug resistance efflux pump [J]. Biochimica et Biophysica Acta， 1993， 1154（2）： 173181.

[12]黃邦彦， 吴立. 柑橘贮藏防腐剂抑霉唑的引进和应用试验[J]. 中国南方果树， 1982 （4）： 1920.

[13]YIN Dafang， CHEN Xiang， MA Zhonghua， et al. Multiple resistance to QOIs and other classes of fungicides in Botrytis cinerea populations from strawberry in Zhejiang Province， China [J]. European Journal of Plant Pathology， 2015， 141（1）： 169177.

[14]BARDAS G A， MYRESIOTIS C K， KARAOGLANIDIS G S. Stability and fitness of anilinopyrimidineresistant strains of Botrytis cinerea [J]. Phytopathology，2008，98（4）：443450.

[15]MYRESIOTIS C， KARAOGLANIDIS G， TZAVELLAKLONARI K. Resistance of Botrytis cinerea isolates from vegetable crops to anilinopyrimidine， phenylpyrrole， hydroxyanilide， benzimidazole， and dicarboximide fungicide [J]. Plant Disease， 2007， 91（4）： 407413.

[16]乔广行，林秀敏，等. 8种杀菌剂对番茄灰霉病菌多重抗药性菌株生物活性测定[J]. 农药， 2013， 52（1）： 5759.

[17]SUN Haiyan， WANG Hancheng， CHEN Yu， et al. Multiple resistance of Botrytis cinerea from vegetable crops to carbendazim， diethofencarb， procymidone and pyrimethanil in China[J]. Plant Disease， 2010， 94（5）： 551556.

[18]FERNANDEZORTUNO D， CHEN F P， SCHNABEL G. Resistance to cyprodinil and lack of fludioxonil resistance in Botrytis cinerea isolates from strawberry in North and South Carolina [J]. Plant Disease， 2013， 97（1）： 8185.

（责任编辑：杨明丽）

推荐访问:蓬莱 抗药性 杀菌剂 霉菌 山东